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利用离心机提取乳酸脱氢酶及辅酶得方法

发布时间:2021-11-24 来源:本站

本实验以乳酸为底物。用新鲜的动物肝脏或肌肉组织的粗制提取液,分别制成酶蛋白部分(用白陶土吸附除去辅酶Ⅰ)和辅酶部分(加热破坏酶蛋白),观察两者单独作用及共同作用的情况。实验中为了便于观察,用甲烯兰(美兰)作为受氢体,已知甲烯兰能从还原型黄酶接受氢而由蓝色变成白色(甲烯白)。所以本实验中根据溶液蓝色的消褪情况判断乳酸脱氢反应的发生。


  实验器材


  水浴锅;离心机;离心管;试管;研钵;剪刀;镊子;实验动物(小鼠、大鼠或兔)。


  实验试剂


  1.玻璃砂 充分洗净。


  2.0.1MpH7.4磷酸缓冲液 称取Na2HPO411.92g,KH2PO42.18g,加水定容至1升。


  3.白陶土 用于吸附辅酶Ⅰ。


  4.0.5%KCN液 称取KCN 0.5g,加水溶解成100ml。


  5.5%乳酸钠溶液 称取乳酸钠5g,加水溶解成100ml。


  6.0.04%甲烯兰液 称取甲烯兰0.04g,加水溶解成100ml。


  实验方法


  1.分别制备酶蛋白提取液及辅酶Ⅰ提取液


  (1)除去辅酶Ⅰ的酶蛋白提取液:取新鲜动物肝(或肌肉)组织3g,剪碎放研钵中加玻璃砂约0.5g,白陶土0.5g,加pH 7.4 0.1M磷酸缓冲液8ml,研成细粥状。移入离心管中,以2000rpm离心机离心5min,倾于另一试管中备用。


  (2)辅酶Ⅰ提取液:取蒸馏水10ml于中试管中,加热煮沸。取新鲜的肝(或肌肉)组织3g,剪碎,放入沸水中,继续煮沸10min,为防止水分过多蒸发可加盖。稍冷后倾入乳钵中研细,移入离心管中放入离心机离心10min,取上清液备用。


  2.取试管4只,标明管号,按下图表加样:


  3.充分混匀,向各管徐徐加人液体石蜡5滴(避免与空气接触),静置试管架上或放37℃水浴15~30min,随时观察并记录各管褪色情况,分析结果。


  注意事项:


  1.KCN剧毒,注意安全。


  2.乳酸脱氢生成的丙酮酸与KCN结合,防止可逆反应发生。


  3.本实验中生成的甲烯白易被空气氧化又转变成甲烯兰,所以在加入液体石蜡后观察褪色时不宜振荡。


  4.  离心机选择合适转数,使用注意安全。


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